Nấm Linh Chi được dùng như “phương thuốc” tăng cường sức khỏe

Nấm linh chi nổi tiếng là một loại thảo dược quý với rất nhiều công dụng trong phòng và chống các loại bệnh tật. Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nấm linh chi và cho chúng ta thấy được tầm quan trọng của nấm linh chi. Vì vậy ngày nay có rất nhiều người sử dụng nấm linh chi để bồi bổ sức khỏe và phòng chống bệnh tật. 

1. Nấm linh chi có tác dụng gián tiếp phòng chống bệnh ung thư

Chất polysaccharides (PS) từ quả thể của nấm linh chi (PS-G) được phân lập và sử dụng để kích thích khả năng sản sinh cytokine của tế bào bạch cầu lympho T đơn nhân, và của đại thực bào. Kết quả của chúng tôi đã chỉ ra rằng tỉ lệ interleukin (IL)- 1 be-ta.

Thành phần diệt tế bào ung thư (TNF)-anpha, và IL- 6 trong đại thực bào được điều trị bằng PS- G (100 mg / ml) là 5.2, 9.8. Tỉ lệ này cao hơn 29 lần so với nhóm không được điều trị.

Ngoài ra, việc sản sinh interferon (IFN) – gamma từ tế bào lympho T cũng tăng mạnh khi có sự sự hiện diện của PS- G (25-100 mg / ml). Hơn nữa, các cytokine chứa tế bào đơn nhân (PSG- MNC -CM) tác dụng phát hiện và ngăn chặn sự gia tăng tế bào mầm của cả hai dòng HL- 60 và U937.

1.1 Phân tích DNA và xét nghiệm điện di cho thấy

Điều trị bằng PSG – MNC -CM tạo ra một số lượng đáng kể tế bào bạch cầu apoptosis. Phân tích dòng cytometric cho thấy số tế bào tự hủy ( 2,3+/-0,8% ) được kiểm soát, trong khi điều trị PSG- MNC–CM dẫn đến một sự gia tăng đáng kể mật độ tế bào apoptosis cả trong HL -60 (38,3 +/-4,5%) và trong các U937 (44,5z+/-3,8%).

Ngoài ra, 40 – 45 % tế bào bạch cầu được kích hoạt để biệt hóa thành tế bào monocytic, thể hiện CD14 và kháng nguyên bề mặt CD68.

Tuy vậy, riêng PS- G [nấm Linh chi đỏ] sẽ không có tác dụng đó ngay cả khi dùng liều cao hơn 400 mg / ml. Khi đại thực bào không được điều trị và tế bào lympho T ít hoặc không sản sinh cytokine, các MNC -CM đã không ngăn chặn sự gia tăng tế bào bạch cầu, có nghĩa là hoạt động kháng u của PSG-MNC-CM được bắt nguồn từ các cytokine cấp cao.

Nghiên cứu kháng thể trung hòa cũng cho thấy các cytokine kháng u trong PSG-MNC–CM chủ yếu từ TNF- anpha và IFN-gamma, có 2 cytokine hoạt động tương hỗ trong việc ức chếc chế tăng trưởng tế bào bạch cầu. Int . J. Ung thư 70:699-705, 1997 Wiley – Liss, Inc.

1.2 Cơ chế về hoạt động kháng u của PS -G [nấm linh chi] là không rõ ràng

Một số nhà nghiên cứu đã cho rằng hoạt động kháng u của PS_G [nấm Linh chi đỏ] có thể liên quan đến việc kích hoạt hoạt động miễn dịch (Wang và cộng sự, 1991).

Tuy vậy, chưa có một bằng chứng thuyết phục và đáng kể nào được ghi nhận. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp nuôi cấy in-vitro để phân tích những tác động của PS- G lên chức năng của đại thực bào và tế bào lympho T, và lên sự phát triển của các tế bào bạch cầu.

Kết quả của chúng tôi cho thấy tỉ lệ lớn cytokine được sản xuất bởi cả đại thực bào và tế bào lympho T đã gia tăng khi điều trị với PS- G [nấm linh chi đỏ].

Sự gia tăng của các tế bào bạch cầu không bị ảnh hưởng bởi riêng PS- G, nhưng nó có tác dụng ức chế đáng kể do PS-G kích hoạt các tế bào đơn nhân (PSG- MNC -CM).

Nghiên cứu trung hòa kháng thể cho thấy hoạt động kháng u của PSG- MNC -CM có nguồn gốc chủ yếu từ cytokine cao cấp, đặc biệt là TNF- anpha, IFN- gamma. Các cytokine này gây ra cơ chế chết tế bào và sự khác biệt trong điều trị tế bào bạch cầu .

2. Nam linh chi đã được sử dụng phổ biến như một phương thuốc để tăng cường sức khỏe và kéo dài tuổi thọ

Nấm linh chi Hàn Quốc được xác định các tác dụng hiệu quả trong điều trị bệnh gan, bệnh cao huyết áp, bệnh tăng đường huyết mãn tính.

Nấm Linh chi đỏ thu hút sự chú ý rất lớn do tác dụng kháng u của hoạt chất polysaccharide. (Nakato và Kayo, 1989; Jane và cộng sự, 1987).

Thí nghiệm trên động vật, nhiều nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng hoạt chất polysaccharides thô và các hợp chất trong nấm linh chi đỏ (PS- G) có thể ngăn ngừa sự phát triển của ung thư mô S180 (Wang và cộng sự, 1991) đồng thời ức chế các tế bào di căn ở chuột (Twan và cộng sự , 1996).

Ngoài ra, một phần ethanol trong dung dịch chiết xuất của nấm linh chi đỏ (PS- G) đã cho thấy tác dụng gia tăng chu kỳ sống của những con chuột được cấy ghép khối u, cho dù dùng riêng PS_G hay kết hợp với thuốc kháng tế bào ung thư khác (Maugui và cộng sự, 1993).

3. Công cuộc nghiên cứu về công dụng của nấm linh chi

3.1 Dòng tế bào

Dòng tế bào ung thư máu của người, HL- 60 và U937 được sử dụng trong nghiên cứu này. Nghiên cứu trước đó được công bố bởi Tiến sĩ M.W.D William (Trung tâm nghiên cứu Ung thư Memorial Sloan-Kettering , New York, NY) và sau này được cung cấp bởi DDPC (Donal Fields, MD). Các tế bào này duy trì RPMI 1640 vừa bổ sung 10% FCS (Hyclone , Logan , UT) và thao tác cấy mô mỗi 2 hoặc 3 ngày.

3.2 Sự chia tách các tế bào đơn nhân và tế bào lympho T

Máu ngoại biên (peripheral) của người được thu thập từ những tình nguyện viên, sau đó bạch cầu được tách ra bằng cách ly tâm mật độ theo phương pháp Ficoll – Hypaque (1,077 g / ml) 400g trong 30 phút.

Tế bào đơn nhân (MNC) cho thấy sự phục hồi ở bề mặt sau khi được tái ly tâm ở RPMI trung bình1640 có chứa 10% FCS. Tế bào lympho T sau đó được tách ra từ MNC bởi rosetting với bromide amino- ethylisothiuronium ( AET ).

Sau 2 lần ly tâm mật độ và tỉ trọng, các tế bào T thu được bằng cách loại bỏ hồng cầu từ tế bào E-rosetting giảm trương lực (Patoia và cộng sự, 1987).

Bạch cầu đơn nhân được phân lập thêm từ tế bào T – được rút cạn MNC bằng cách ủ thêm ở 36°C trong 120 phút. Sau thời gian đó, tế bào lympho còn lại đã hoàn toàn được rửa sạch, tế bào monocytic sau đó được thu thập bằng cách cọ sat nhẹ với một miếng cao su (Billy Dorothy, Vineland, NJ).

3.3 Chuẩn bị PS -G

Nấm linh chi được rửa sạch, và trích xuất bằng nước sôi trong vòng 8 đến 12 giờ. Hệ thống treo được lọc hoặc ly tâm để loại bỏ chất không hòa tan, và chất polysaccharide hòa tan được làm giàu được cô lập bằng ethanol trong bước thứ 2.

Các polysaccharides thô thu được sau đó thông qua phương pháp lọc gel Sephadex G50 (Pharmacel, Uppsala, Thụy Điển), được tinh chế thêm bằng cách cho trao đổi anionvowis DEAE-cellulose (Kayo và Nagakato 1983).

Để loại trừ các nội độc tố (LPS) do ô nhiễm của các mẫu PS -G [nấm linh chi ], trong một số thí nghiệm, phương pháp điều tiết PSG bằng cách kích thích đại thực bào của người (xem bên dưới) đã được thực hiện do sự có mặt của 5 đến 10 mg / ml polymyxin B (Sigma , WoodenB, MO ).

Ngoài ra, các đại thực bào màng bụng có C3H/HeJ trong chuột được thu thập và ủ ở 36° C trong 3 ngày có hoặc không có PS -G [nấm Linh chi đỏ] và LPS.

Các điều kiện sau đó được chuẩn bị và đánh giá đối với dịch não và tủy, sử dụng phương pháp khảo nghiệm bằng nuôi cấy vô tính của CFU – GM (Wang và cộng sự, 1992b )

3.4 Điều kiện môi trường

Để điều tra tác động của PS- G [nam linh chi] trong việc kích thích các tế bào miễn dịch sản sinh cytokine, một số lượng bạch cầu đơn nhân thuần nhất, đại thực bào (2×105/ml) và tế bào lympho T (1X106ml) được ủ riêng trong RPMI trung bình -1640 có chứa 10 % FCS có hoặc không có nồng độ (3,13-400µg mg/ml ) của PS -G [nấm Linh chi đỏ] ở 36° C trong 1-3 ngày. Các điều kiện môi trường (CM ) sau đó được thu thập, lọc và lưu trữ ở 270 ° C cho đến khi sử dụng.

Để kiểm tra các hoạt động kháng u của đại thực bào và tế bào lympho T, CM được chuẩn bị bằng cách ủ các tổng MNC (1X106/ml ) ở 36°C trong 3 ngày cùng với ( PSG- MNC -CM ) không có (MNC -CM ) của một liều tối ưu (100 µg/ml) PS -G [nấm Linh chi].

4. Khảo nghiệm đối với các cytokine

Điều kiện môi trường của trường hợp không được điều trị bằng PS -G hoặc kích thích đại thực bào , tế bào lympho T có hoặc không có polymyxin B đã được khảo nghiệm cho hoạt động của IL-1b, IL-6, TNF-a and IFN-g, sử dụng phương pháp Cistran ( Cana Brook , NJ).

Hệ thống (đối với IL- 1b và TNF- a) và R & D ( Minneapolis, MN ) ( cho IL- 6 và IFN- g ), gồm một enzyme liên kết khảo nghiệm immunoabsorbent pha rắn (LASSY) như mô tả của nhà sản xuất.

4.1 Điều trị tế bào bạch cầu

Dòng tế bào bạch cầu của người như HL- 60 và U937 được duy trì trong RPMI trung bình-1640 chứa 10% FCS , được lưu giữ theo cấp số nhân.

Trong các thử nghiệm, các tế bào được bảo quản ở nồng độ ban đầu 1X105/ml trong đĩa Petri có hoặc không có từ 10 đến 20% (vol / vol) PSG- MNC -CM hoặc MNC -CM.

Để phát hiện các ảnh hưởng trực tiếp của PS -G [nấm Linh chi đỏ] trên sự gia tăng các tế bào bạch cầu, một nhóm đã được điều trị riêng với một mình PS- G ở liều lượng từ 100 đến 400 mg/ml, tương đương với 10 đến 40 lần số lượng PS- G [nấm Linh chi đỏ] được bổ sung vào môi trường PSG- MNC -CM.

Các mẫu sau đó được ủ ở 36° C trong 5 ngày, và tế bào sống được đếm trên ngày 1 , 3 và 5 bằng cách sử dụng phương pháp thử nghiệm loại trừ của Trypan-blue. Ngoài ra, miễn dịch huỳnh quang cũng được thực hiện cho các mầu thu thập trong ngày thứ 5.

5. Khảo nghiệm clonogenicity

Sự tăng trưởng vô tính của tế bào HL- 60 hoặc U937 được đánh giá trong chất làm đông (Wang và cộng sự, 1992). Trong 1 khoảng thời gian ngắn, 1X103 HL- 60 U937 được cấy trong 1ml chất đông 0,3% trong RPMI trung bình 1640, chứa 15 % FCS, với nồng độ khác nhau của PS -G (50-100 mg / ml ) [nấm Linh chi đỏ], MNC -CM (5-10% , vol / vol) được thêm vào tại thời điểm mạ.

Môi trường này được ủ trong 14 ngày ở 36° C trong độ ẩm có 5% CO2 ( ^ 50 tế bào ). Trong một số thí nghiệm , các tế bào bạch cầu (1X105/ml) được trước ủ trong 12 đến 48 giờ trong các môi trườn hóa lỏng có hoặc không có PSG- MNC -CM, sau đó rửa sạch và phân tích clonogenicity trong môi trường không có phụ gia Phân tích quá trình apoptosis

DNA Hypodiploid được phân tích bằng phương pháp prodiumidid (PI) ghi nhãn và đo dòng tế bào, như mô tả của Natalie và cộng sự (1997), Chalotte và cộng sự (1993), cùng với một sửa đổi nhỏ.

Tế bào bạch cầu sau một thời gian ngắn, được điều trị hoặc không được điều trị (1,5X106) và rửa sạch, lưu trữ trong 1,5 ml dung dịch nhược trương fluorochrome ( PI 50mg/ml trong 0.1% sodium citrate và 0,1% Triton- X 100) (Sigma).

Mẫu được đặt ở 5° C trong bóng tối, và PI huỳnh quang của từng mẫu được phân tích bằng FACScan Flow cytometer (Richard Bentleman, Lincoln Park , NJ) hoặc quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (Olympus AX900, Tokyo, Nhật Bản).

Mảnh vỡ tế bào bị loại khỏi phân tích bằng cách nâng cao ngưỡng phân tán, các thành phần DNA của tế bào là intacted đươc phân tích trên quy mô lo-ga-rit. Nhân tế bào tự hủy có chứa hypodiploid ADN phát huỳnh quang trong khoảng từ 10-400 được liệt kê theo tỷ lệ phần trăm của tổng.

5.1 DNA gel điện

Tế bào HL- 60 hoặc U937 không được điều trị PSG- MNC -CM (3X106) được hòa với 0,5 ml dung môi giải đệm [5 mM Tris –borate (pH 7,5) , 0,26 ml Matenet M- 42 (Sigma) và 1 mM EDPB], sau đs thêm RNase (Sigma) nồng độ 200 mg/ml, và ủ ở 36° C trong 2 giờ.

Các tế bào được xử lý tiếp với proteinase K (300 mg/ml) thêm 2 giờ, và AND sau đó phân lập từ tế bào lưu trữ như mô tả (Anthony và cộng sự, 1994).

Thực hiện điện phân trên 1,5% agarose gel trong dung môi Tris-borate (pH 7,5) gồm 1 mM EDPB. DNA trong gel được nhuộm với ethidium bromide.

Từ khi tế bào HL-60/U937 được điều trị bằng PSG- MNC – CM, xuất hiện sự lắng cặn trong quá trình ủ, xuất hiện các biểu hiện của các kháng nguyên khác biệt monocytic, CD14 và CD68, được phát hiện bằng cách sử dụng phương pháp huỳnh quang gián tiếp.